对于许多初入实验室的新手来说，接触最多的实验技能可能就是PCR和Western blot，而对于一些更为复杂的实验技术可能还不太熟悉。近期，我也开始了涉及泛素化的实验，因此今天想和大家探讨一下泛素化的基本概念以及如何检测目标蛋白的泛素化水平。

首先，我们要了解什么是泛素化。泛素化是一种生化过程，在这个过程中，泛素分子会在E1、E2、E3三种酶的作用下，特异性地连接到目标蛋白上，或是已经连接到蛋白上的泛素链上。值得注意的是，泛素化的过程是动态的，目标蛋白上的泛素数量不是固定不变的。

一、实验前的准备工作

进行泛素化检测的基础是确定蛋白质的泛素化水平。这需要我们明确以下几点：

1. 我们所选择的目标蛋白是否会发生泛素化。

2. 目标蛋白上的哪个赖氨酸残基会发生泛素化。

在实验前，对这些问题的深入了解至关重要。推荐大家使用PhosphositePlus数据库查询蛋白质的翻译后修饰信息，包括泛素化等。

二、选择实验方法

泛素化的检测方法有很多种，以下几种是较为常见的：

1. 利用Western blot检测所有泛素化的蛋白条带，通过目的蛋白的抗体和特异泛素化抗体进行反应，判断目的蛋白的泛素化水平。

2. 通过免疫沉淀（IP）方法分离和收集目标蛋白，分析其修饰特性，然后使用泛素化抗体进行检测。

3. 在工具细胞中转染目标蛋白，使其在细胞内高表达，然后与特定的泛素化蛋白或肽段孵育，通过IP或WB进行分析检测。

这些方法各有利弊，可以根据实验目的进行选择。

三、泛素化实验注意事项

实验前期：

1. 泛素化检测通常需要使用免疫沉淀技术，因此选择一个好的试剂盒非常重要。市面上推荐的试剂盒品牌包括abcam、thermo、invitrigen等，国产试剂盒也有不错的表现，可以根据预算进行选择。

2. 在泛素化检测中，蛋白酶体抑制剂的使用不可忽视。常用的抑制剂有MG132和lactacystin，它们分别抑制26S和20S蛋白酶体。实验中可能需要对不同抑制剂进行探索，以找到对特定蛋白最敏感的方案。

实验操作：

1. IP实验中，为防止蛋白降解和提取不充分，除非特别说明，所有操作都应在冰上进行。

2. 如果未能获得足够的靶蛋白，可以尝试增加细胞或组织裂解物的浓度，增加裂解物中总蛋白的含量，或更换新的蛋白酶抑制剂。

3. 在IP实验中，要提前计算好抗体的使用量，如有疑问，建议咨询技术支持，抗体的使用量可以适当提高。

实验结果分析：

1. 通过IgG对照组排除轻重链的影响，并验证是否存在非特异性结合。

2. 泛素分子量约为8.5kDa，蛋白质可能发生单泛素修饰、多泛素修饰或多聚泛素化修饰。当泛素抗体缺乏特异性时，只要目的蛋白上连接了泛素化多肽，就会在膜上产生条带，出现拖尾现象。

近年来，泛素化的研究一直是科研热点，相关研究成果也层出不穷。如果对泛素化研究感兴趣，可以查阅更多资料，共同学习进步。